Interaktion der FO Statoruntereinheiten a und b der ATP-Synthase aus Escherichia coli

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Titel: Interaktion der FO Statoruntereinheiten a und b der ATP-Synthase aus Escherichia coli
Autor(en): Konrad, Stephanie
Erstgutachter: Prof. Dr. K. Altendorf
Zweitgutachter: Prof. Dr. H. Wieczorek
Zusammenfassung: Interaktion der FO Statoruntereinheiten a und b der ATP-Synthase aus Escherichia coli Die ATP-Synthase nimmt im Energiestoffwechsel vieler Organismen eine zentrale Stellung ein und ist ubiquitär in strukturell und funktionell homologer Form bei eukaryotischen Zellen in der inneren Mitochondrienmembran, der Thylakoidmembran von Chloroplasten und in der Cytoplasmamembran von Prokaryoten zu finden. Besonders zwischen F-, V- und A-Typ ATPasen bestehen strukturelle Ähnlichkeiten im Aufbaus des Gesamtenzyms aus zwei großen Subkomplexen. Darüber hinaus weisen die F-Typ ATPasen aller Organismen hohe Sequenzhomologien auf, welche sich auch in strukturellen Gemeinsamkeiten widerspiegeln. Als "Modellenzym" dient die FOF1 ATPase aus dem Enterobakterium Escherichia coli. Es setzt sich aus acht funktionell verschiedenen Untereinheiten zusammen, die unter Hydrolysebedingungen relativ zueinander rotieren. Die Unterteilung der Enzymstruktur in Rotor (g e -c-Oligomer) und Stator (a 3b 3d ab2) erfordert das Vorhandensein einer stabilisierenden Struktur, dem sog. "second stalk". Im Hinblick auf den Mechanismus der rotierenden ATP-Synthase und dem Modell der elastischen Kopplung erscheint die Untereinheit b geeignet, um die durch das g e -c-Oligomer aufgebaute Rotationsspannung zu speichern. Wie die beiden b Untereinheiten mit den anderen FO Untereinheiten a bzw. c interagieren ist weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Dissertation wurden die Untereinheiten a und b auf mögliche Interaktionsstellen mit anderen Enzymuntereinheiten mittels genetisch eingefügte Cysteine und anschließender chemischer Quervernetzung untersucht. In der hier vorgestellten Arbeit konnte gezeigt werden, dass es mit dem Nulllängen Cross-linker Cu(1,10-Phenanthrolin)2SO4 [CuP] in der Region bP28C-bE39C möglich ist, Quervernetzungen zur Untereinheit a zu erzeugen. Mit den heterobifunktionellen Cross-linkern Benzophenon-4-maleimid [BPM] und N-[4-(p-Azidosalicylamido)butyl]-3´-(2´-pyridydithio)propionamid [APDP] vergrößert sich diese Region. Dabei sind die a-b Interaktionen in einer gewissen Periodizität (bP28C, bL29C, bM30C, bA31C, bK38C und bE39C) zu beobachten, was für eine Beteiligung beider b Untereinheiten spricht. Neben dem immunologischen Nachweis durch Antikörper, konnte auch über ein N-terminales Polyhistidinmotiv (His12) gezeigt werden, dass eine Interaktion zwischen den Untereinheiten a und b ausbildet wird. Der aN-His12-b Cross-link kann mittels Ni-NTA Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. b-Dimerisierungen konnten für die Reste bS60C, bL65C und die Region bY24C-bA45C nachgewiesen werden. Der relative Abstand der b Untereinheiten zueinander nimmt dabei in ihrem Verlauf vom Cytoplasma in Richtung Membran zu, wie mit den Cross-link Reagenzien CuP, BPM und APDP gezeigt werden konnte. Ausgehend von der Untereinheit a konnten für die Reste aS27C, aN33C, aA130C, aG173C, aP182C, aN184C, aS202C und aG227C ebenfalls CuP vermittelte Quervernetzungen mit der Untereinheit b nachgewiesen werden. Die Reaktion an der Position aS27C weist auf eine cytoplasmatische Lokalisation des N-Terminus hin, die in einem 6 Transmembran-Sekundärstrukturmodell vorgeschlagen wird. Mit BPM konnte die Nähe der Aminosäuren aN33C und aP182C zum c-Oligomer gezeigt werden.
URL: https://repositorium.ub.uni-osnabrueck.de/handle/urn:nbn:de:gbv:700-2002040519
Schlagworte: E. coli; F-Typ ATPase; Cystein Mutagenese; Cross-linker; Cu(110-Phenanthrolin)2SO4; Benzophenon-4-maleimid; N-[4-(p-Azidosalicylamido)butyl]-3´-(2´-pyridydithio)propionamid
Erscheinungsdatum: 5-Apr-2002
Enthalten in den Sammlungen:FB05 - E-Dissertationen

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