Entwicklung von Systemen zur quantitativen Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration und der in vivo Aktivität der Adenylatzyklase CyaA in einer isogenen Stammreihe von Escherichia coli K-12

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Titel: Entwicklung von Systemen zur quantitativen Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration und der in vivo Aktivität der Adenylatzyklase CyaA in einer isogenen Stammreihe von Escherichia coli K-12
Autor(en): Siepelmeyer, Jörg
Erstgutachter: Prof. Dr. Josef W. Lengeler
Zweitgutachter: Prof. Dr. Karl-Heinz Altendorf
Zusammenfassung: Die Regulation des Kohlenstoffkatabolismus erfolgt in Escherichia coli wesentlich über den Einfluss der intrazellulären cAMP-Konzentration auf die Expression der Gene des crpA-Modulon. cAMP wird durch die Adenylatzyklase CyaA synthetisiert, die wiederum durch phosphoryliertes IIACrr aktiviert wird. Im Rahmen eines Stoffwechselmodellierungsprojektes sollten durch die Entwicklung von Systemen zur quantitativen Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration und des Phosphorylierungszustands von IIACrr zwei entscheidende Parameter dieses Regulationsnetzwerkes untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein System zur reproduzierbaren, direkten Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration in E. coli etabliert. Zur in vivo Bestimmung der intrazellulären cAMP-Konzentration wurden zwei verschiedene durch cAMP·CrpA regulierte Promotoren mit den Reportergenen für ß-Galaktosidase oder Aequorin (grün fluoreszierendes Protein) fusioniert und in drei verschiedenen Messkonstrukten untersucht. Die Zugabe von Pyruvat zu gehungerten Zellen führte zu einer Desphosphorylierung von IIACrr. Der so direkt gezeigte Einfluss des PEP/Pyruvat Verhältnisses auf das Phosphorylierungsgleichgewicht von IIACrr zeigt einen Mechanismus, über den PTS-unabhängige Substrate den Phosphorylierungszustand von IIACrr verändern und somit die Aktivität der Adenylatzyklase beeinflussen können. Bei der Untersuchung zur zellulären Lokalisation der Adenylatzyklase in E. coli mit Hilfe einer CyaA-Aequorin-Fusion wurde nach Überexpression des Fusionsproteins eine lokale Anhäufung der Fluoreszenz an den Zellpolen beobachtet. Da bei geringerer Expression der Fusion kein Fluoreszenzsignal mehr erfasst werden konnte, war eine endgültige Lokalisierung der Adenylatzklase mit dieser Methode nicht möglich.
URL: https://repositorium.ub.uni-osnabrueck.de/handle/urn:nbn:de:gbv:700-2003072526
Schlagworte: Escherichia coli; Kohlenhydratstoffwechsel; cAMP; Adenylatzyklase; IIACrr; Lokalisation; Gfp; PEP; Pyruvat
Erscheinungsdatum: 25-Jul-2003
Enthalten in den Sammlungen:FB05 - E-Dissertationen

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