Mutagenesestudien an F-ATPasen aus E. coli : Auswirkungen zentraler Blockaden der elastischen Rotoreinheit gamma und Visualisierung der Relativrotation unter ATP Synthesebedingungen

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Titel: Mutagenesestudien an F-ATPasen aus E. coli : Auswirkungen zentraler Blockaden der elastischen Rotoreinheit gamma und Visualisierung der Relativrotation unter ATP Synthesebedingungen
Autor(en): Ahlbrink, Stephanie
Erstgutachter: apl. Prof. Dr. Siegfried Engelbrecht-Vandré
Zweitgutachter: Prof. Dr. Wolfgang Junge
Zusammenfassung: 1. Aufgrund der Resultate mit der Mutante MM10, die trotz Disulfidbrücke noch unverminderte Aktivität und Rotation zeigte, wurde der Frage nachgegangen, ob der EF1-Komplex in der Lage ist, die Rotation durch einen Bruch der alpha-helikalen Struktur von gamma oder durch Rotation um eine Einfachbindung der Disulfidbrücke aufrechtzuerhalten. Quervernetzungen vom Hexagon mit gamma in der Mitte und am unteren Ende konnten das Enzym blockieren. Von den vier betrachteten Mutanten KG11, MM26, MM25 und MM24 fiel der MM26 bereits nach der Isolierung raus. Der MM25 wies nicht mehr als 70% Quervernetzung auf. Bei dem KG11 und dem MM24 konnte jedoch eine 99%-ige Quervernetzung nachgewiesen werden. Mit diesen zwei Cystein-Doppelmutanten wurden weitere Quervernetzungen gefunden, die ebenso wie der MM10 aktiv nach Oxidation sind, aber tiefer im Enzym liegen und die ATP-Hydrolyse trotz Blockade durch Quervernetzung aufrecht erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass eine Rotation um die Einzelbindungen innerhalb der Disulfidbrücke unwahrscheinlich ist, und daher die Aktivität des quervernetzten Enzyms nur durch eine Aufwindung der gamma-Helix erklärt werden kann. 2. Die Voraussetzung für ein EFOF1-Kostrukt zum optischen Nachweis der Relativrotation unter Synthesebedingungen war der Einbau von zwei verschiedenen Tags zur spezifischen Bindung. Von den vier Mutanten SE3, SE4, SW7 und WH1 zeigten die beiden SE-Mutanten keine Stabilität bei der Isolierung im Bezug auf die Kopplung zwischen FO- und F1-Teil. Mit dem SW7-EFOF1 wurde eine Mutante gefunden, die mit einer guten Aktivitäts- und Rotationsausbeute nach einer Aufreinigung mittels Streptactin-Affinitätchromatographie durch ihre Stabilität als Ausgangspunkt für das Rotationsexperiment unter ATP-Synthese dienen kann. Der WH1, dessen atp-Operon dem des SW7 gleicht, brachte trotz seines veränderten Vektorursprungs keine Verbesserung.
URL: https://repositorium.ub.uni-osnabrueck.de/handle/urn:nbn:de:gbv:700-2007011719
Schlagworte: F-ATPase; Untereinheit gamma; Rotation; Disulfidbrücke; ATP-Synthese; ATP-Hydrolyse; EFOEF1; EF1
Erscheinungsdatum: 16-Jan-2007
Enthalten in den Sammlungen:FB05 - E-Dissertationen

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